【作用与用途】  用于猪血液、脾脏、淋巴结、肾脏组织样品中的非洲猪瘟病毒核酸的检测。

【用法与判定】

1 用法

1.1 样品处理

1.1.1 全血、血清、血浆直接进行下一步试验。淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肌肉等组织样品取0.1~0.2g（黄豆粒大小）加入10倍体积约1~2ml生理盐水，采用不同方法制成组织匀浆液。

1.1.2 根据待检样品数量，取1.5ml离心管依次加入100μl缓冲液B1（恢复至室温并混匀使用），然后再加入10μl全血（EDTA抗凝剂）或20μl组织匀浆液、血清、血浆样品混匀，室温3分钟内涡旋混匀3~5次。

1.1.3 向上述混合液中加入100μl缓冲液B2（恢复至室温并混匀使用），涡旋混匀，12000转/分钟离心1分钟，上清为PCR待检核酸；如在2小时内检测则PCR待检核酸置于4℃保存，否则置于﹣20ºC以下保存。

1.1.4 肉骨粉、血粉或环境样品等可使用病毒基因组提取试剂盒进行提取，然后再进行下一步试验。

1.2 扩增试剂准备  根据检测样品数量每个PCR反应管加入18μl PCR反应液；先取2μl阴性对照、再取2μl PCR待检核酸、最后取2μl阳性对照（充分混匀）分别加到不同的PCR反应管中，加样结束后应盖紧PCR反应管，每个PCR反应管内液体的体积为20μl。

1.3 PCR反应  加样后将PCR反应管瞬时离心，然后置于荧光PCR仪内，进行如下反应：

1） 95℃预变性20秒；2） 95℃变性10秒，58℃延伸20秒，共40个循环；设置58℃收集FAM荧光信号。

2 判定

结果的有效性  阳性对照应出现特异性扩增曲线且Ct值＜35，且阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值，则试验成立；否则试验不成立。

结果判定  当样品的扩增结果有典型的扩增曲线且Ct值<40时可判定为非洲猪瘟病毒核酸阳性，Ct值<30时可判定为非洲猪瘟病毒核酸强阳性；当样品的扩增结果无Ct值或背景信号之下时，判定为非洲猪瘟病毒核酸阴性。

【注意事项】

（1） 使用本试剂盒的实验室应严格按照国家有关规定进行管理。

（2） PCR反应液对温度敏感容易失活，使用时应置于冰上，使用后应立即冻存，每盒反应液冻融次数不宜超过3次。

（3） 缓冲液B1、B2使用前融化恢复至室温并充分摇匀，融化恢复至室温的缓冲液B1、B2可室温保存。

（4） 扩增试剂准备时应按阴性对照、待检核酸、阳性对照的顺序加入PCR反应管中。

（5） 吸取反应液时，应尽量避免产生气泡；加样结束后应盖紧反应管，以免液体蒸发造成结果不准确。

（6） 处理样品用器械及废弃物品应高压灭菌。检测过程中使用过的吸头，应直接打到盛有10% 84消毒液的带盖废物缸内。检测结束的PCR反应管，严禁开盖不得高压处理。

（7） 工作台及各种实验用品应定期清洁并用10% 84消毒液或紫外灯进行防污染处理。

（8） 各区域物品均为专用，不得交叉使用，以免污染。检测结束后，应立即对工作台进行清洁。

（9） 严禁使用超过有效期限的试剂；不同批号的试剂请勿混用。

【规格】  （1）10检份/盒（2）25检份/盒（3）50检份/盒（4）100检份/盒

【贮藏与有效期】  -20℃以下冷冻保存，有效期12个月。