摘要：为评价不同厂家非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒的效果，选择当前市场上6个厂家的商品化试剂盒，检测不同类型样品，结合统计学方法对试剂盒的特异性、敏感性和重复性等性能指标进行比对分析。结果显示：6个厂家的试剂盒ROC曲线下区域面积（AUC）为0.826~0.951，Youden指数为0.76~0.90，说明试剂盒的排他性和包含性等特异性指标总体表现较好；最低检出限（LOD）等敏感性数据显示，6个厂家试剂盒的LOD为10-1~102 copies/μL，说明各试剂盒的敏感性均较理想；用高、低浓度样品对试剂盒分别进行批内、批间重复性试验，发现高浓度样品的批内、批间变异系数（CV）为0.10%~1.28%，说明重复性较好，仅有2个厂家的试剂盒在检测低浓度样品时表现较好，批内CV为2.25%~6.12%，批间CV为2.93%和4.93%，说明不同试剂盒检测低浓度样品时稳定性较差。本研究为商品化荧光PCR检测试剂盒的评价提供了参考。非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，临床上以高热、网状内皮系统出血和高死亡率为特征，严重危害养猪业发展。世界动物卫生组织（WOAH）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。2018年8月我国首次报道ASF疫情。目前该病尚缺乏有效的预防疫苗和针对性治疗药物，因此精准剔除阳性动物尤为重要。荧光PCR检测方法具有敏感、快速、灵敏等优点，检出下限为6个质粒拷贝或0.1~1.0 TCID50/mL，是实现精准剔除的最佳方法。但近年新出现的ASFV变异毒株具有排毒量低、不易检测等特点，这对试剂盒的敏感性和特异性提出了更高要求。本试验选取了6个厂家的ASFV荧光PCR检测试剂盒，参照OIE《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2018年版）1.1.6章推荐的程序要求，对其特异性、敏感性和重复性进行了比较分析，以期了解各个试剂盒的性能特点及差异。ASF阳性样品，包括血清、全血及组织；ASF阴性样品，包括组织和血清；ASFV核酸标准物质和特异性对照，包括疫苗和抗原。ASF阴、阳性样品，由市级动物疫病预防控制中心实验室初步检测，再由广东省动物疫病预防控制中心复检确定，详见表1。
本次试验使用的荧光PCR仪为罗氏LC480，所有仪器均已通过计量校准；试剂盒为6个厂家的ASFV荧光PCR检测试剂盒，分别用A、B、C、D、E、F表示，每个厂家产品各检测2个批次；DNA提取试剂盒为广州达安基因股份有限公司产品。DNA提取及PCR检测 DNA提取按照达安基因核酸提取纯化试剂盒（磁珠法）说明书进行，荧光PCR检测按照6个厂家相应的试剂盒说明书进行。分析特异性（analytical specificity，ASp） 使用72份ASF阳性样品、6份ASF阴性组织样品、2份ASF阴性血清样品，评价检测试剂盒的包含性。使用2份猪繁殖与呼吸综合征疫苗、2份猪瘟兔化弱毒株疫苗、2份口蹄疫（A、O、Asia I）抗原混合物、2份伪狂犬病毒核酸标准物质，评价试剂盒的排他性。结合统计学中的诊断特异性（diagnostic specificity，DSp）、诊断敏感性（diagnostic sensitivity，DSe）、Youden指数、受试者工作特征曲线（receiver operating charaCteristic curve，ROC曲线）等统计学方法，综合评价试剂盒的分析特异性。计算公式：式中a为真阳性数，b为假阳性数，c为真阴性数，d为假阴性数。分析敏感性（analytical sensitivity，ASe） 使用终点稀释法，将ASFV核酸标准物质进行10倍梯度稀释，得到稀释度依次为100~10-7的8份样品，对每份样品进行3次重复检测，以确定试剂盒的最低检出限（LOD）。绘制标准曲线，计算核酸含量（copies/μL），综合评价试剂盒的分析敏感性。重复性（repeatability） 选取稀释度为10-1和10-3的ASFV核酸标准物质，由两名实验人员使用各试剂盒的批内及批间产品，对每个稀释度样品进行5次重复检验，根据检测结果计算变异系数（CV），评价试剂盒的重复性。统计学分析 使用Microsoft Excel和SPSS 26.00，对上述结果进行统计分析。样品盘包括88份样品，其中ASF阳性样品72份、ASF阴性样品16份。诊断特异性结果显示，B、C、D、E、F试剂盒的特异性均达到了100%，仅有A试剂盒为87.50%；诊断敏感性从高到低依次为E＞A/B＞F＞C/D；Youden指数从高到低依次为E＞B＞F＞C/D＞A。具体结果见表2。
利用SPSS软件绘制ROC曲线并计算ROC曲线下区域面积（AUC）。当AUC＞0.9时，代表检测结果准确性高，AUC越大，试剂盒的准确性越高。如图1和表3所示：有5个试剂盒的AUC＞0.9，说明大部分受测试剂盒准确性较高，AUC从大到小依次为E＞B＞F＞C/D＞A，与Youden指数结果一致。
对8个稀释度（100~10-7）的ASFV核酸标准物质，分别进行3次重复检验，根据结果绘制标准曲线。结果（图2）显示，受测试剂盒A、B、C、D、E、F的标准曲线斜率分别为-3.57、-3.67、-3.33、-3.63、-3.36、-3.63，线性回归系数分别为0.993 0、0.999 2、0.985 0、0.999 6、0.998 0、0.999 2，均较理想。A、B、E、F的LOD均为10-1~100 copies/μL，C为100~101 copies/μL，D为101~102 copies/μL，由高到低依次为A/B/E/F＞C＞D，说明受测试剂盒的LOD均能达到10-1~102 copies/μL。
对10-1和10-3两种稀释度的ASFV核酸标准物质进行检测发现（表4），检测高浓度样品时，试剂盒的重复性较好，批内及批间的CV均控制在1.5%以内。在检测低浓度样品时，试剂盒的重复性较差，因此仅对检出率达到80%以上的试剂盒进行CV分析，结果批内CV为2.25%~6.12%，批间CV为2.93%和4.93%，批内、批间差异均较大。ASF疫情发生后，养猪从业者的生物安全意识普遍增强，生物安全措施不断得到改进和完善。但由于病毒污染面广，且田间毒株不断发生变异，使得ASF流行情况复杂多变，尤其是弱毒株的感染，隐蔽性强，严重危害养猪生产。在缺乏有效疫苗和针对性治疗手段时，精准剔除阳性动物十分重要，而实现精准剔除的前提是应用快速、准确的诊断方法，而具有特异性强、敏感性高、重复性好等优点的荧光PCR检测技术是最佳选择。该技术被认为是迄今为止最灵敏可靠的方法之一，因此对荧光PCR试剂盒的性能
