生物安全三级实验室涉及一、二类病原微生物的大量培养、病原分离和毒力测定等试验操作，所有活病原微生物均需要灭活后才能离开生物安全三级实验室。高压蒸汽灭菌法属于常规灭菌方式，需根据病原微生物种类，感染性废弃物和动物尸体等不同消毒灭菌对象，建立相应的操作规程，并进行效果验证，以保证实验室生物安全。牛型结核菌素是将牛分枝杆菌接种适宜培养基后，经高压灭活和三氯乙酸提纯的细菌代谢蛋白及其衍生物

        可用于牛结核病诊断。按照《动物病原微生物实验活动安全要求细则》，牛分枝杆菌的大量液体培养，需要在生物安全三级实验室条件下开展。研究结果表明，高压灭菌条件对于牛型结核菌素蛋白的成分和活性有较大影响，所以，针对牛分枝杆菌应探索和建立一个既能保证灭菌效果，又能最大限度保留蛋白生物学活性的灭菌模型。本研究通过型式试验，优化了排空、升温、灭菌和排气等阶段的各项参数，最终建立了牛分枝杆菌高压灭菌模型，以期为防范人畜共患病原菌扩散，改进牛型结核菌素提纯制备工艺提供技术支持。
        仪器设备　双扉生物安全型灭菌器（BIST-P3），购自山东新华医疗器械股份有限公司；隔水式恒温培养箱（GNP-9270），购自上海精宏实验设备有限公司。试验试剂　压力蒸汽灭菌生物指示剂（嗜热脂肪地芽孢杆菌ATCC7953含菌量1×105~5×106 CFU/支）

        购自山东新华医疗器械股份有限公司；121 ℃压力蒸汽灭菌化学指示卡（20200606），购自北京四环卫生药械有限公司；配氏培养基、硫乙醇酸盐流体培养基（TG）、胰酪大豆胨液体培养基（TSB）、酪胨琼脂（GA），购自北京中海生物科技有限公司。

        方法灭菌柜装载物放置　装载架上放置8个灭菌箱，平均分布在上下两层。每个灭菌箱内放入6个与制备牛型结核菌素体积相同的纯净水三角瓶。试验时将锅体内的移动感温探头插入到上层中间的液体三角瓶中，盖好中间有透气孔的硅胶瓶塞。指示剂放置　试验时，在每层4个灭菌箱外侧角和内侧角的三角瓶中放入生物指示剂，共12个点位。在中间上下2个箱体的2个点位分别放入1张化学指示卡。灭菌结束后，取出生物指示剂和化学指示卡，按照说明书进行结果判定。灭菌柜高压参数设置　选用灭菌柜预设液体高压程序作为基准参数：灭菌温度为121 ℃，灭菌时间为20 min，排空上限为60 kPa，排空下限为0，排空次数为3次，升温间隔为180 s，排气间隔30 s，排气压差12 kPa，冷却温度90 ℃。分别对排空、升温、灭菌、排气阶段的有关参数进行比较试验，确定最佳灭菌参数。满载牛分枝杆菌挑战试验　按照确定的最佳灭菌参数，在灭菌腔最大装载条件下，将液体培养的牛分枝杆菌全部放入，运行程序。结束后按照《中华人民共和国兽药典（三部）》无菌检验规定进行检验。同时设立配氏培养基作为阳性对照，阳性对照置37 ℃恒温培养箱中培养15~30 d，观察并记录结果，此试验重复3次。