摘要
背景：非洲猪瘟病毒自2018年进入我国后，对我国的养猪行业造成了巨大的经济损失。由于荧光PCR技术具有操作简单、敏感性高、检测时间短等优势，目前已经广泛应用于非洲猪瘟病毒病毒的检测，以便于及时精准剔除，降低养殖场的损失。
目的：1.通过检测系列稀释的VP72标准质粒评估标驰泽惠试剂盒的分析灵敏度；2.通过检测特异性样品评估标驰泽惠试剂盒的特异性；3.通过检测灭活阳性样品评估标驰泽惠试剂盒的检测灵敏度。
结果：1.标驰泽惠生产的非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒，能够检测低于1-5个拷贝数的阳性质粒，具有高度的分析灵敏度；2.标驰泽惠试剂盒对伪狂犬病毒、蓝耳病毒、流行性腹泻病毒、猪圆环II型病毒的40份灭活阳性样品和60份阴性样品无反应，具有高度的特异性；3.对于30份非洲猪瘟病毒的灭活阳性样品，同等检测条件下标驰泽惠试剂盒的CT值显著低于两种参比试剂盒（分别购自M公司和S公司）的CT值，表明标驰泽惠的非洲猪瘟荧光PCR试剂盒具有更高的灵敏度。
, ,,,,,关键词：非洲猪瘟病毒，qPCR，灵敏度，特异性，比对试验
01材料
1.1 非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒
分别由北京标驰泽惠生物科技有限公司、M公司和S公司生产。
1.2 VP72标准质粒
购自TianTech。
1.3 特异性样品
包含伪狂犬病毒、蓝耳病毒、流行性腹泻病毒、猪圆环II型病毒灭活阳性样品各10份，以及采集自2018年6月之前的阴性样品60份，合计100份特异性样品。
1.4 灵敏度样品
30份非洲猪瘟病毒灭活阳性样品，由合作单位实验室收集和赠送，其中包含感染早期样品12份（高CT值样品）。
02方法
三种试剂盒分别按照说明书操作，其中标驰泽惠试剂盒检测步骤如下：
2.1 反应体系
20μL的荧光反应液+5μL的样品，同时设立阴阳对照。
2.2 反应程序
95℃，3min；95℃，10s，60℃，35s，45个循环。
2.3 判定标准
阳性对照CT＜30，阴性无照无扩增曲线则检测实验成立，样品CT＞38为阴性；CT≤38，为阳性。
03实验结果
3.1 分析灵敏度验证
以1、5、10、102、103、104、105、106、107、108、109 copies/μL的VP72标准质粒为待测样品，按照标驰泽惠上述反应体系和程序设定评估标驰泽惠试剂盒的分析灵敏度。
以CT值为Y轴，以标准质粒浓度的log对数为X轴，构建荧光PCR标准曲线（见图1），标准方程为Y=-3.9715X+40.387，相关系数R2为0.9997，表明标驰泽惠试剂盒CT值与相对应标准质粒浓度之间具有良好的线性关系（见图1），且最低能够检测出1-5 copies/μL的VP72标准质粒，具有高度的分析灵敏度。
3.2 特异性检测
随机选取伪狂犬病毒、蓝耳病毒、流行性腹泻病毒、猪圆环II型病毒的灭活阳性样品各10份，以及2018年6月之前采集的阴性样品60份，合计100份样品。提取核酸后，按照说明书检测非洲猪瘟病毒核酸。结果显示100份样品均未出现特性扩增曲线和CT值，表明标驰泽惠非洲猪瘟荧光PCR试剂盒具有高度的特异性。
3.3 灵敏度检验
选取30份非洲猪瘟阳性样品，其中感染早期样品12份。分别使用标驰泽惠、M公司和S公司非洲猪瘟荧光PCR试剂盒同时进行比对试验，结果显示标驰泽惠检测试剂盒对30份样品均能检出，灵敏度为100.00%，M公司试剂盒对早期感染样品的检测出现4份样品的漏检，S公司试剂盒对早期感染样品的检测出现2份样品的漏检 。
值得注意的是，对于感染早期样品（高CT值）标驰泽惠试剂盒也可以检出，参比试剂盒（M公司和S公司）有不同程度的漏检。）
非洲猪瘟病毒进入我国后，野毒株和基因缺失株的流行对养猪行业造成毁灭性的损失。尤其是基因缺失株具有隐蔽性更强、潜伏期更长、间歇性排毒、临床症状不典型等特点，在临床上对感染非洲猪瘟猪群的鉴别诊断和精准剔除增加了难度，同时对非洲猪瘟病毒的实验室诊断技术提出了更灵敏、更特异、更准确的要求。
在本次试验中，标驰泽惠非洲猪瘟荧光PCR试剂盒能够检出低至1-5copies的标准阳性质粒；100份特异性样品全部为阴性；30份灵敏度样品全部为阳性。对于高CT值的样品，标驰泽惠试剂盒也可以全部检出，这对定点拔牙、早检测早发现将非常有帮助，对非洲猪瘟的防控具有重要意义。
北京标驰泽惠生物科技有限公司生产的非洲猪瘟荧光PCR试剂盒新兽药证书转自中国动物疫病预防控制中心，经国家权威部门批准授权生产。搭配自主开发的猪内源基因作为参照，能够方便的监控样品采集、核酸提取及PCR扩增过程中是否存在异常。另外，试剂盒采用了国际上优秀的酶、MIX等原料制成，试剂盒稳定性好，操作方便，易于储藏和运输。
05供稿老师简介
杜皓云，预防兽医学硕士。北京标驰泽惠生物科技有限公司研发员，负责非洲猪瘟，猪圆环等荧光定量PCR检测试剂盒研发工作。
