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牛型结核菌素标准物质及其制备方法

发布时间:2022-12-05 09:07:23人气:25

1.一种制备牛型结核菌素标准物质的方法,其特征在于制备步骤如下:  提纯牛型结核菌素

 (1)培养基 载于“农业部兽用生物制品规程委员会,中华人民共和国兽用生物制品规程, 2000年版,化学工I业出版社, 2000"中的苏通合成培养基,成分包括如下,门冬素4g、柠檬酸2g、硫酸镁0. 5g、磷酸氢二钾O.5g、柠檬酸铁铵O. 05g、甘油60ml ,每种成分均为分析纯,加蒸馏水940ml ,共制备50000ml ;

 (2)菌种 中国兽医药品监察所提供的牛分枝杆菌C68001和C68002株;生产用种子制备1) -级种子制备接种将冻干菌种开封后,接种小川培养基置37°C温室中培养两周,发育生长呈黄色颗粒状菌落或菌苔,为-级种子;  二级种子制备用钼金铲钩取- -级种子菌苔或菌落,均匀涂布于数支小川培养基斜面上,置37°C温室中培养10天,即可发育良好,此培养物用作液体驯化;为使生长在固体培养基上的结核菌种能在液体培养基中生长繁殖,以适应结核菌素生产的需要,应于生长前期将菌种接种于液体培养基上,进行种子驯化工作;用钼金铲从小川培养基斜面上钩取菌苔,

在合成培养基试管内壁充分研细,然后倾斜试管,用培养基 轻轻接触菌体,使其浮在培养基液面上,缓慢移至37°C温室中培养7~15日,则在培养基表面形成薄的菌膜;用钼金环挑出一块菌膜移植到苏通合成培养基瓶中,在37°C温室中培养7一15日,即可在培养瓶液体表面形成具有弹性的菌膜,再菌膜移植到苏通合成培养基瓶中,在37°C温室中培养7一15日, 在球瓶液体表面上形成微有皱褶、弹性较强的菌膜,此菌膜即可作为大量生产的种子,为二级种子; 二级种子鉴定肉眼观察,液体必须清亮,菌膜纯粹、薄白、无杂菌污染,对于液体不清亮的培养物弃去; 

(3)菌素制造1 )接种挑取菌膜徐徐放入瓶的液面上,持瓶者好瓶塞,轻轻放回原处,接种完毕后,应对已接种的培养基瓶逐瓶进行检查,发现有种子下沉或散开者进行再接种,接种结束后,小心移入温室中,轻放于培养架上; 2)培养培养期间须定期检查温度、湿度和有无杂菌生长,污染者及时高压灭菌弃去; 3)灭活培养2一3个月,菌膜生长较厚,停止培养,培养物置121°C灭活30min 。

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(4)混合粗滤首先用双层纱布加一-层铜纱将两个菌株同一批号相同瓶数的培养瓶培养物混台滤过除去菌膜; 5)细滤在滤器中加入8块甲3滤板,打开空气压缩机电源使纯化水完全通过滤器;将混合菌液吸入储料罐,再使之完全通过滤器,即为结核菌素滤液, 40000ml ; 6)提纯将附录中1倍体积的40%三氯醋酸溶液徐徐加入到9倍体积的结核菌素滤液中,边加边搅拌,混匀后,在2一8°C静置14-24小时,使蛋白沉淀;然后小心将上清吸出,收集沉淀;用附录中1%三氯醋酸溶液将沉淀物重新悬浮混勻,再经4000r/min, 2一8°C 30min离心沉淀去上清,如此3次,最后一次离心结束后,弃上清称重,并减去离心管重量得到湿蛋白净重, 70g;重溶过滤将沉淀物先加附录中的Imol/L氢氧化钠溶液约7ml ,使之溶解;根据湿蛋白净重和适当的稀释倍数计算出稀释后菌素总体积和需要附录中pH7.4磷酸盐缓冲液的体积;先量取少量PH7. 4磷酸盐缓冲液将离心管内菌素浓缩液进行稀释,并用量筒转移至3000m瓶,再用剩余体积的pH 7. 4磷酸盐缓冲液对离心管和量筒进行2次洗涤并先后转移至3000ml瓶,此即为单批的提纯牛型结核菌素原液;将提纯牛型结核菌素原液进行适当稀释, 调pH到7.4 ,用灭菌赛氏滤器过滤即为候选物。

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