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非洲猪瘟荧光定量PCR检测常见假阳性结果分析

发布时间:2022-11-21 09:24:09人气:8

非洲猪瘟疫情发生两年多以来,养殖从业人员对于非洲猪瘟疫情的认识从最初的漠不关心,到谈非色变,如今多数猪场已经找到了防控非洲猪瘟的办法,发现非洲猪瘟可防可控,并不可怕。目前,养猪业通过精准检测发现病原,同时有效执行生物安全措施使得非洲猪瘟防控取得了可喜的进展,可有效遏制疫情发生和蔓延。

非洲猪瘟在我国暴发之初,养殖从业人员对于生物安全管理存在畏难心理,对非洲猪瘟病毒了解不够,普遍认为生物安全太难,无法有效执行。发生非洲猪瘟后,精准清除执行不到位,以至于几乎全军覆没,损失惨重。从今年很多猪场的经验来看,生物安全真正落实到位是可行且行之有效的。另外,选择敏感、稳定、性能优异的检测方法,结合有效的阻断措施后,精准清除的成功率非常高。

荧光定量PCR检测出现假阳性的常见原因

1. 实验室污染是导致假阳性结果的主要原因

非洲猪瘟野毒感染时血液和组织中病毒载量非常高,经常检测到Ct值15左右的样本。样本处理和提取的过程中需要进行离心操作,这些高浓度的样本离心时容易造成气溶胶污染。对于血液和组织样本,检测非洲猪瘟病毒应该尽可能减少离心操作,这类样本病毒载量高、样本较纯净,可以采用免提取检测。

实验室如果长期检测阳性样本,扩增产物中高浓度的目的片段很容易扩散到空气中并不断累积导致气溶胶污染。

核酸自动提取仪可显著提高实验效率,然而,养殖企业实验室大多使用中小型核酸自动提取仪,并且没有适当的防污染措施,在样本处理过程中可能出现交叉污染。相对于气溶胶污染,样本处理过程中交叉污染导致的假阳性概率较小。

2. 荧光定量PCR试剂盒污染或者非特异性反应

某些试剂盒没有在GMP车间进行生产,或者GMP车间生产过程中车间洁净度不够或人员操作不规范,在试剂盒生产过程中可能出现阳性核酸片段或者质粒污染反应体系的情况。

某些试剂盒生产工艺不过关,可能出现非特异性翘尾现象。

试剂盒中引物、探针等原料品质不过关,质量控制不严格,也可能导致非特异性反应。

3. 荧光定量PCR仪性能不佳导致翘尾

笔者发现某些荧光定量PCR仪性能不佳,在反应后期出现非特异性翘尾峰。

4. 电压不稳导致的基线不稳定

很多养殖企业将实验室设置在猪场附近,使用电源大多是农用电,电压不稳定,会导致扩增基线不稳定。另外,猪场附近的临床实验室停电风险相对较高。建议这些实验室配备UPS紧急电源。

5.样本或者气泡干扰

反应体系中存在气泡或者某些样本含有特殊成分可能干扰实验,产生非特异性扩增曲线,这种扩增曲线通常不呈现典型的S型扩增曲线形态。

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非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒

如何降低实验室污染和假阳性?

实验室质量管理的关键要素通常离不开人、机、料、法、环,保证实验室质量,减少实验室污染也离不开这几个要素。

1. 加强人员培训,养成良好的实验习惯,建立有效的沟通和激励制度

实验室质量管理最核心的要素是人,必须培养良好的实验操作和卫生习惯;

荧光定量PCR实验室分试剂配制区、样本处理区、核酸扩增区,严格分区管理;

不同区域的移液器用不同的标识区分,防止混用;

不同区域使用不同颜色的实验服区分,防止混穿;

不同区域的耗材、垃圾桶、锐器盒、抹布、拖把不混用;

实验完成后使用84消毒液擦拭地面、台面及移液器等;

实验完成后使用紫外消毒车0.5m左右照射台面30min;

严禁在实验室打开扩增后的荧光定量PCR管,严禁在实验室区域对扩增后的荧光定量PCR产物进行高压灭菌或者加热处理。

2. 选择性能良好的核酸提取仪和荧光定量PCR仪

大型的全自动化核酸提取仪设计时会引入分区设计、紫外防污染、层流防污染等措施,在选购核酸自动提取仪时应该考虑仪器的防污染性能。可以通过阴阳性样本交叉摆放,同时提取最大检测量的样本,来评估核酸提取仪的防污染性能。

关于荧光定量PCR仪的选择,某些仪器热盖设计存在严重缺陷,扩增结束后液体挥发严重,大量扩增产物泄漏,这种荧光定量PCR仪极易导致气溶胶污染。

3.选择带UNG酶防污染体系和内参的荧光定量PCR试剂盒

科学的试剂盒会引入UNG酶防污染体系,同时通过产品设计,保证PCR扩增效率。在降低气溶胶污染同时,保证检测的敏感性。

在荧光定量PCR扩增原料中不加TTP,只加UTP,扩增产物是含有UTP的核酸片段。UNG酶可以水解含有UTP的核酸片段,在扩增程序前添加UNG酶反应程序,可水解反应体系中含UTP的扩增产物,然后使用95℃高温灭活UNG酶,再运行荧光定量PCR反应程序,可以大幅度降低扩增产物气溶胶污染。

某些试剂盒附带的阳性对照浓度非常高(Ct值<25),频繁使用极易造成气溶胶污染。

使用带内参的荧光定量PCR试剂盒监控每个反应是否正常;使用弱阳性的样本(27<Ct值<35)作为阳性质控,监控提取和PCR反应的稳定性;尽量减少阳性对照的使用,可有效降低污染风险。


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